- Calculez les scores des deux alignements suivants à
l’aide de matrices de substitution ci-dessous.
| |
A |
T |
C |
G |
| A |
2 |
0 |
0 |
1 |
| T |
0 |
2 |
1 |
0 |
| C |
0 |
1 |
2 |
0 |
| G |
1 |
0 |
0 |
2 |
Pénalités :
- Ouverture de gap: 7
- Extension de gap: 1
Alignment A :
A T G T C A T A C G T
A A G T C A - - - G T
Alignment B :
A T G T C A T A C G T
A A G T C - - A - G T
Questionnaire : Calcul de score des alignements
- Quel est le score de l’alignement A ?
- Quel est le score de l’alignement B ?
- EN vous basant sur ce score, quel alignement vous semble le plus pertinent ?
- Quel est l'intérêt d’utiliser des matrices de score pour aligner des séquences ?
- Quel alignement privilégieriez-vous du point de vue biologique ? Justifiez votre réponse.
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Alignement global de deux opsines
Buts de cet exercice
Dans cet exercice, nous allons aligner les séquences par
paires et mesurer les taux d'identité et de similarité entre
quelues séquences d'opsines.
Le but est d’apprendre
à choisir une matrice
de substitution appropriée pour comparer deux séquences
protéiques.
Sur base de note connaissance de la fonction des protéines
analysées (toutes des opsines), on s'attend a priori à
ce que la similarité de séquence couvre l'ensemble des
séquences. Nous allons donc utiliser le
logiciel needle,
qui effectue un
alignement
global entre deux séquences.
Téléchargez de Swissprot les
séquences protéiques des opsines vertes et bleue de la
souris et l'opsine bleue humaine.
- Ne sélectionnez que les séquences de la base de
données SwissProt (la section d’Uniprot qui contient des
séquences revues par les annotateurs, contrairement aux
autre protéines qui sont annotées de façon automatique
sur base de recherches de similarités de séquences).
- Dans Uniprot, utilisez l'option "Advanced search" pour
collecter les séquences spécifiques d'un organisme (voir
TD1).
- Attention! Uniprot contient certaines
séquences courtes, qui ne correspondent qu'à des
fragments de la protéine complète. Ces fragments
peuvent facilement être incorporés dans un alignement,
mais les statistiques de similarité ne reflèteront pas
la situation biologique réelle. Pour cet exercice,
nous allons écarter les séquences fragmentaires. A cet
effet, vous pourriez ajouter, dans les paramètres
avancés, une contrainte sur la longueur de la séquence
(acceptez les séquences de 300 à 1000 résidus).
Alignez l'opsin bleue de la souris avec opsin bleue
humaine, et avec l'opsine verte de la souris (vous
devrez donc effectuer séparément 2 alignements par
paire), en utilisant les paramètres par défaut
de needle.
Pour chaque résultat, notez les valeurs des
- scores bruts
- % d'identité
- % de similarité
- % des gaps
- Comme à priori on ne connait pas le % d’identité
entre les séquences on choisit un matrice de substitution
prévue pour les séquences d’un pourcenatge d'identité modéré.
- Needle suggère par défaut la
matrice BLOSUM62. (Cliquer sur le
bouton "More options" dans "STEP2"
pour voir les paramètres). Cette matrice est
destinée pour la comparaison de protéines présentant
au moins 62% d’identité.
Observez le pourcentage d’identité entre chaque pair des protéines,
et réaligner les si vous jugez qu’une autre matrice de substitution
conviendrait mieux.
Questionnaire : Alignement global avec l’algorithme Needleman et Wunsch
Comparez les pourcentages d'identités et de
similarités entre les alignements par défaut et determinez la matrice
de substitution optimale pour chaque alignement (le détail des questions
sera fourni dans le questionnaire).
Expliquez les différences entre les alignements des mêmes séquences ontenus
avec les matrices de substitutions différents.
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Alignement global vs. alignement local
Dans cet exercice, nous alignerons la séquence du gène de
l’opsine bleue humaine avec son ARNm, en utilisant deux
algorithmes d'alignement par paire:
Le but de l'exercice est de comprendre les
différences entre ces deux alignements, et d'évaluer l'impact de
certains paramètres sur le résultat.
Vous allez utiliser deux programmes de la suite
EMBOSS: needle,
qui implémente l’algorithme d'alignement global publié par
Needleman et Wunsch (1970) et water,
l’algorithme d'alignement local publié par Smith et Watermann
(1981).
Le but de l’exercice
- Apprendre à interpréter le résultat d'un alignement par paires.
- Comprendre la différence entre alignement local et global.
- Percevoir l’effet de changement des paramètres pour
l'alignement.
- Récupérez les séquences du gène de Alpha-haemoglobin humaine (V00491)
à partir de Genbank et la séquence de son ARNm (CAA23750) à partir d'
EMBL-EBI.
- Alignez les ces séquences par needle,
puis par water,
en utilisant des paramètres par défaut.
- Comparez les deux alignements. (Répondez aux questions
correspondantes dans le questionnaire)
- Faites varier les paramètres d’ouverture des gaps (Gap
Open; go) et extension des gaps (Gap Extend; ge) de l'alignement local (water) et
comparez les alignements obtenus avec les différents
paramètres.
- Gap open= 10, Gap Extend= 0.5 (paramètres par défault)
- Gap open= 1, Gap Extend= 0.5
Les paramètres de pénalité de gaps sont
accessibles en cliquant sur le lien "More options",
dans la section "STEP2 - Set your pairwise alignment
options".
- Gap open=1, Gap Extend=1
Questionnaire : Alignement global vs. alignement local
Comparez les deux alignements (global versus local)
obtenus avec les paramètres par défaut: longueur
d'alignement, nombre d'identités, pourcetages d'identités,
différences marquantes entre les deux alignements.
Différences les plus marquantes entre alignements global
et local (1 ou 2 phrases)
A quels éléments du gène correspondent les gaps?
Pourquoi les scores des deux alignements sont-ils
identiques, en dépit des différences soulignées ci-dessus (1
phrase)?
Que se passe-t-il quand vous diminuez le score
d'ouverture de gap à 1 et le score d'extension reste à 0.5?
Pourquoi (2-3 phrases) ?
Que se passe-t-il quand vous choisissez le score
d'ouverture à 1 et le score d'extension à 1?
Parmi les 3 choix de paramètres de l'alignement local
que vous avez testés,
le(s)quel(s) vous paraît le plus pertinent ? Justifiez en 1
phrase.
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Exercice facultatif pour les mordus - Matrices de substitution
Les matrices de substitution associent un score à chaque paire
de résidus. Pour ce premier exercice, l'ensemble des étudiants
contribuera à construire une matrice de substitution en suivant
les étapes suivantes :
Alignement des deux séquences.
Comptage des occurrences pour chaque paire de résidus
→ création de matrice de comptage.
Transformation de matrice de comptages (= occurrences =
fréquences absolues) en matrice de fréquences
(relatives)
Transformation de matrice des fréquences en lod-scores
(voir définition du lod score).
Notes
ATTENTION! Comptez non seulement les
substitutions, mais également les identités, car ce nombre
est nécessaire au calcul du nombre total d'occurrences
pour chaque acide aminé.
Pour cet exercice, nous allons tricher en alignant les
séquences à l’aide de programme needle
(de la suite EMBOSS), qui utilise déjà une matrice de
substitution pour faire l’alignement.
Nous nous permettrons cette petite entorse afin d'éviter
un problème de circularité: les alignements de séquences
protéiques reposent sur une matrice de substitutions, mais
les matrices de substitution sont construites sur base
d'alignements.
On peut dès lors se demander comment les premières
matrices ont été constuites. En 1978, Margaret Dayhoff
et ses collègues avaient aligné les séquences sur base
d'estimations arbitraires des relations entre acides
aminés, pour ensuite dériver de ces alignement les
premières matrices de substitution basées sur des
alignements: les matrices de la série PAM
(Dayhoff et al. 1978).
Quand vous aurez rempli le formulaire concernant
votre alignement et votre matrice
individuelle de substitution, sauvegardez la page
Web juste avant de soumettre vos
résultats, afin de conserver une trace des
données que vous avez encodées.
Juste après avoir votre
matrice individuelle, le programme vous proposer
d'accéder à la matrice
collective, qui résulte de la somme des matrices
individuelles soumises par les
étudiants. Sauvegardez également cette page, pour
conserver une trace de son état au moment de votre
soumission. La matrice collective sera ensuite
périodiquement actualisée, au fil des soumissions de vos
collègues. Pour répondre aux questions du
questionnaires, utilisez la version de la matrice
collective que vous avez sauvegardée juste après la
soumission de votre matrice individuelle.
Construction d'une matrice de substitution à partir d'alignements
Connectez-vous au site de Carl
Hermann.
Le site Web propose à chacun une paire de protéines tirées au
hasard dans une banque de données. Vous allez aligner ces
protéines, et d'en dériver un matrice de comptages des
alignements par résidus (substitutions, identités, gaps).
Sur base d'un seul alignement, cette matrice sera forcément
très fragmentaire. Cependant, vos résultats seront
automatiquement cumulés avec ceux des autres étudiants pour
construire une matrice collective basée sur un nombre
suffisant d'alignements. Vous comparerez ensuite la matrice
que vous avez construite avec la matrice classique BLOSUM62.
Vous pouvez répondre à des questions du questionnaire au fur
et à la mesure.
Questionnaire : Matrices de substitution
- Exploration de la matrice produite par votre alignement personnel.
- Identifiant de la protéine 1
- Nom du gène 1
- Nom de l'organisme 1
- Identifiant de la protéine 2
- Nom du gène 2
- Nom de l'organisme 2
- Longueur de l'alignement
- Nombre d'identités (symbole | )
- Substitutions conservatives (symbole : )
- Substitutions non-conservatives (symbole . )
- Pourcentage d'identités (nombre entre 0 et 100, sans le symbole %)
- Pourcentage de similarités
- Somme des termes diagonaux de votre matrice
- Somme des termes hors-diagonale de votre matrice
Exploration de la matrice produite par le groupe d'étudiants.
Note: la matrice de substitutions
collective se complètera au fil du TD. Il est donc normal
que vous ayiez des résultats différents de vos voisins.
- Acide aminé le plus fréquent
- Comptage pour cet acide aminé
- Fréquence de cet acide aminé
- Comptage des identités pour cet acide aminé
- Formule du log-odds pour cet acide aminé (indiquez le détail du calcul, avec les valeurs numériques des termes de la formule)
- Susbtitution présentant le nombre le plus élevé de comptages (indiquez les deux résidus)
- Comptage pour cette substitution
- Formule du log-odds pour cette substitution (indiquez le détail du calcul, avec les valeurs numériques des termes de la formule)
- Matrice des lods : Observer les scores des identités (diagonales). Les scores les plus élevés sont-ils associés aux comptages les plus élevés ?
- A quoi cette différence est-elle due ?
Exploration de la matrice BLOSUM62:
analyse de la
"remplaçabilité" des
résidus.
Attention, les 4 dernières lignes et
colonnes de la matrices correspondent à des acides
aminés ambigüs ou à des gaps. Pour cet exercice, ne
prendez en compte que les substitutions entre acides
aminés complètement spécifiés.
- Quel est le score d'identité le plus élevé de la
matrice de lod-score BLOSUM62 (indiquez le score et
l'acide aminé) ?
- Quel est le score de substitution le plus élevé de
cette matrice (score + paire d'acides aminés) ?
- Comment interprétez-vous ce score de substitution
élevé ?
- Que veut dire le score de 0 pour la substitution A-G ?
Comparaison de la matrice de scores calculés par les
étudiants et la matrice de BLOSUM62 :
- Vous trouverez sûrement les différences entre les deux
matrices. A quoi ce différence sont-elles dues ? Répondez
en une ou deux phrases.
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Exercice facultatif pour les mordus - Programmation dynamique
From paths to scored alignemnts
In this exercise, we will get familiar with the algorithm used
to find the optimal alignment between two sequences.
- Draw a matrix with the following sequences
- STVSSTQV on the horizontal margin
- ASKTEVSS on the vertical margin
- Draw an arbitrary path joining the top-left to the
bottom-right corner of this matrix. At each step of the
path, you can take 3 directions: right, bottom, or
right-bottom diagonal. The other 5 directions are
forbidden. Each student should draw a different path, so we
explore a good variety of paths and evaluate the resulting
scores.
- Write the alignment corresponding to your path.
- Score this alignment with
the BLOSUM62 substutition matrix, and a
gap penalty of -3 (for this exercise, we use the same
penalty for gap opening and extension).
- Compare the paths, aligments and scores obtained by the different
students.
Finding the optimal path by dynamical programming
In the exercise above, we evaluated the scores of a variety of
possible alignments between two short peptidic fragments. We
will now apply the dynamical programming algorithms, which
guarantees to return the optimal alignment, i.e. the alignment
maximizing the score, for a given substitution matrix and
gap penalty.
- Open a connection to the alignment
applet.
- Type your sequences in the options "first sequence" and
"second sequence", respectively.
- Use the applet to build the optimal alignment.
- Compute the score of the resulting alignment.
- Compare this alignment with those obtained in the previous exercise.
Bibliographie
Dayhoff, M. O., Schwartz,
R. M. & Orcutt, B. (1978).
A model of evolutionary change in proteins.
Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 345--352.
Premier article proposant de construire les matrices de
substitutions sur base de fréquences des résidus alignés
dans une collection d'alignements (par paires). Une série de
matrices est dérivée de la matrice empirique, sur base d'un
modèle théorique qui repose sur une hypothèse d'homogénéité
des taux de substitutions au cours de l'évolution.
Henikoff, S. & Henikoff, J. G. (1992).
Amino acid substitution matrices from protein blocks.
Proc Natl Acad Sci U S A 89, 10915-9.
Construction d'une série de matrices de substitution à
partir de blocks conervés au sein d'alignements
multiples. Série de matrices empiriques construites à partir
de blocks plus ou moins similaires (chaque matrice provient
de blocs d'alignements sélectionnés sur base d'un taux
d'identité donné). La série de matrices repose donc sur des
observations directes, plutôt que sur un modèle évolutif
particulier.
Emese Meglécz
(IMBE,
Aix-Marseille Université)
&
Jacques van Helden
(TAGC,
Aix-Marseille Université).
