BLAST (suite), alignements multiples et motifs protéiques

1. Lisez la fiche Uniprot de la protéine Aro1 (P08566) de levure du boulanger Saccharomyces cerevisiae, et tentez de comprendre la façon dont cette protéine est organisée.

2. Analysez les étapes métaboliques catalysées par cette enzyme dans la voie de biosynthèse du chorismate de la base de données MetaCyc.

3. Utilisez l'outil protein blast du NCBI BLAST pour chercher des séquences similaires dans le sous-ensemble de la base de données non-redonante restreinte aux protéines de la bactérie Escherichia coli K-12 (TAXID 83333).

   • La bactérie Escherichia coli a servi d'organisme modèle aux biochimistes et généticiens pendant des décennies. Etant donné son intérêt pour la recherche et la médecine, on dispose actuellement de génomes complètes pour des centaines de souches de la même espèce. Il est donc nécessaire de préciser la souche qui nous intéresse, en indiquant son identifiant taxonomique (TAXID).
   • Pour sélectionner un organisme, vous pouvez commencer à taper sonnom dans l'option Organism du formulaire BLAST. Quand vous commencez à entrer le nom de l'orgnaisme, l'interface Web vous présente une liste avec le sous-ensemble des organismes correspondant à ce que vous avez tapé. Ceci permet de sélectionner aisément le nom correct.

1. Lancer les deux BLAST dans deux fenêtres différentes.
2. L’identifiant de votre séquence requête est P25688 dans le deux cas.
3. Vous pouvez utiliser les paramètres par défaut des BLAST, mais
• choissiez la banque de refseq-proteins et la banque refseq_genomic.
• limiter votre recherche à des séquences humaines dans la boite ‘organism’.

Protocole

1. Télécharger le fichier fasta les opsines bleues des quelques mammifères ici .

Le format FASTA est un format de fichier texte utilisé pour stocker des séquences biologiques de nature nucléique ou protéique.

Pour chaque séquence, le fichier fasta contient une ligne d'identification qui commence par le signe >, suivi immédiatement par l'identifiant de la séquence, puis par au moins un espace et les éventuels informations supplémentaires. Les lignes suivantes contiennent la séquence elle-même.

2. Dans une fenêtre séparée, connectez-vous à l'outil ClustalW de l'EBI.

3. Lancez un alignement multiple avec votre fichier contenant uniquement les opsines bleues en utilisant les paramètres par défaut.

4. Affichez les couleurs sur la page de résultat (Show colors).

5. Alignez les mêmes séquences sur le site Clustal du PBIL (Pôle Bioinformatique Lyonnais). L'alignement est assez rapide, et ce site présente des informations complémentaires à celui de l'EBI.

1. Téléchardez le fichier avec les opsines vertes et rouges des primates ici.

2. Dans une fenêtre séparée, ouvrez une nouvelle connexion à l'outil ClustalW de l'EBI ou Clustal du PBIL, selon vos préférences.

3. Alignez les séquences des opsines vertes et rouge des primates.

4. Visualisez l'alignement dans JalView ou si ce n'est pas possible, affichez la cloloration dans l'alignement.

5. Essayez d'identifier les résidus susceptibles d'intervenir dans la différence de perception entre opsines vertes et rouges.

1. Téléchardez le fichier avec toutes les opsines des mammifères ici.

2. Dans une fenêtre séparée, ouvrez une nouvelle connexion à l'outil ClustalW de l'EBI, et alignez les séquences.

   • Observez le graphique de l'arbre-guide qui est généré quand vous ouvrez l'onglet guide tree sur le site de EBI.

     Vous pouvez consulter la page des concepts pour obtenir des informations concernant l'arbre-guide.

   • En principe, dans l'alignement, les opsines bleues devraient apparaîre clairement séparés des opsines rouges et vertes.

3. Alignez ces séquences sur le site Clustal du PBIL (nous suggérons de refaire l'alignement sur ce site car le formatage des résultats facilite l'analyse des positions de blocs conservés).

4. Analysez les positions des blocs les plus conservés, et les régions plus variables, en les comparant avec les annotations des différentes régions de l'opsine humaine sensible au vert.

Prosite

1. Connectez-vous au site de Prosite, une base de données des sites fonctionnels et des domaines protéiques.
2. Trouvez la fiche qui décrit le motif bZIP.
3. Retrouvez l'expression régulière qui décrit les positions relatives et les fréquences des acides aminées clefs dans le motif bZIP (voir: Consensus pattern de BZIP_BASIC, PS00036; Basic-leucine zipper (bZIP) domain signature (PATTERN))

WebLogo

1. Observez l'alignement multiple en format clustal qui était utilisé pour identifier le motif bZIP.
2. Téléchargez l'alignement multiple en format fasta.
3. Sur le site de WebLogo, créez un logo basé sur l'alignement multiple en utilisant l'alignement en format fasta.

Alignement par paire des séquences non-apparentées

1. Utilisez l'outil random sequence du site RSAT (http://rsat.ulb.ac.be/rsat/, pour générer 10 séquences nucléique de 100 bases chacune).

   L'outil random sequence se trouve parmi les sequence tools dans le menu à gauche

   • Entrez les bonnes valeurs pour les options Sequence length et number of sequences.
   • Choisissez option Independent and equiprobable nucleotides afin d'obtenir des séquences où la fréquence de chaque nucléotide est de ~25%.
   • Cliquez GO pour soumettre votre requête, et suivez le lien Result file(s) > sequence pour accéder au résultat.

2. Dans un nouvel onglet, ouvrez une connexion a l'outil needle, que nous allons utiliser pour effectuer des alignements globaux pour quelques paires de ces séquences aléatoires (faites 5 alignements au total).

• Revenez à vos séquences aléatoires, copiez la première séquence (rand_1) et collez-la dans la boîte first sequence du formulaire needle.
• Copiez la seconde séquence (rand_2) et collez-la dans la boîte second sequence du formulaire needle.
• Ouvrez une feuille de calcul (par exemple dans OpenOffice), et notez, pour chaque alignement par paire, les statistiques d'alignement suivantes:
  1. longueur de l'alignement
  2. nombre d'identités
  3. nombre de similarités
  4. nombre de gaps
  5. pourcentage d'identités (copiez-le à partir du résultat de needle)
  6. pourcentage d'identités (recalculez-le vous-même au moyen d'une formule pour vous vous assurez que vous comprenez son mode de calcul)
  7. pourcentage d'identités sans tenir compte des gaps (calculez cette grandeur au moyen d'une formule)
• Répétez les opérations ci-dessus pour quelques paires de séquences:
  • rand_1 versus rand_3
  • rand_1 versus rand_4
  • rand_1 versus rand_5
  • rand_1 versus rand_6
3. Calculez ensuite la moyenne de chaque colonne de votre feuille de calcul.

Alignement multiple des séquences non-apparentées

1. Faites un alignement multiple des 10 séquences aléatoires avec ClustalW pour séquences nucléiques au PBIL

Dans le formulaire ClustalW, n'oubliez pas de spécifier que vous allez aligner les séquences d'ADN.

1. Effectuez une recherche structurée (option Advanced search) dans Uniprot pour identifier les protéines selon les critères suivants:

   1. les protéines doivent provenir d'un mammifère (Taxonomy ID: 40674).
   2. le nom doit contenir "opsin"
   3. la séquence doit couvrir au moins 300 aa
   4. le nom de la protéine ne peut contenir ni "melanopsin", ni "rhodopsin", ni "rod"

   Il est très important que votre requête soit formulée précisément pour appliquer les cirtères ci-dessus, sans quoi vous vous retrouverez avec des centaines de protéines, et vous perdrez énormément de temps pour les tâches ultérieures.

   1. Au terme de cette sélection, vous devriez avoir obtenu entre 100 et 200 protéines, pas plus.
   2. Pour écarter des protéines lors d'une requête avancée Uniprot, vous pouvez utiliser l'opérateur logique NOT, dans le menu déroulant qui précède l'option Field.

2. Personnalisez l'affichage des résultats en cliquant sur l'option Customize de la table de résultats d'Uniprot.

   1. Affichez 250 lignes résultats par page (option rows), pour éviter de devoir trop souvent passer d'une page à l'autre. !
   2. Ajoutez au résultat des colonnes indiquant la classe, l'ordre, la famille de chaque espèce, et le longueur des séquences.

      Pour ajouter des colonnes, cliquez sur Columns > Taxon ID > Show. Ceci fera apparaître une nouvelle liste d'options avec les niveaux taxonomiques cochez les cases Class, Order et Family, puis cliquez sur le bouton Show, et confirmez en cliquant Save. Vous devriez alors voir apparaître les colonnes "Taxon ID (Class)", "Taxon ID (Order)", et "Taxon ID (Family)".

   3. Triez les résultats par ordre alphabétique des noms d'espèces, en cliquant sur les petits triangles devant l'en-tête de la colonne "Organism", afin de facilement voir tous les opsines disponibles pour chaque espèce.

3. Sélectionnez (en cochant les cases devant l'identifiant) entre 20 et 30 opsines, selon les critères suivants :

   1. Sélectionnez d'abord toutes les opsines impliquées dans la vision des couleurs (short-wave-sensitive, medium-wave-sensitive et long-wave-sensitive) pour les organismes suivants.
      • humain (Homo sapiens)
      • macaque (Macaca fascicularis)
      • babouin (Papio anubis)
      • ornithorynque (Ornithorhynchus anatinus)
      • lapin (Oryctolagus cuniculus)
      • souris (Mus musculus)
      • rat (Rattus norvegicus)

      ces opsines particulières seront nécessaire pour répondre aux questions ci-dessous.

   2. Sélectionnez ensuite quelques autres espèces réparties sur des ordres différents de mammifères, pour arriver à un total de 20 à 30 opsines
   3. Attention, veilllez à répartir la sélection entre opsines sensibles au bleu, au vert et au rouge.
   4. Assurez-vous que les séquences sélectionnées soient complètes (la longueur des opsines bleues tourne autour des 350aa, celle des vertes et rouges autour de 360aa)

4. Après avoir effectué votre sélection manuelle, sauvegardez la page Web, pour conserver une trace dans l'état.

   Nous expliquons ci-dessous comment sauvegarder les résultats sous différents formats (séquences fasta, fichier de tableur), mais il est toujours prudent de conserver une copie de vos résultats dans l'état où ils vous apparaissent initialement sur un site Web. Nous vous suggérons de sauvegarder régulièrement les pages web de résultats aux différentes étapes du TD qui suit.

5. Téléchargez les séquences sélectionnées en format fasta.

   Attention: si vous cliquez sur le bouton orange Download en haut de la table de résultats, vous téléchargerez les séquences pour l'ensemble des résultats de la requête.

   Pour télécharger uniquement les séquences sélectionnées, cliquez sur le bouton Retrieve dans la règle verte qui est apparue au bas de la page dès que vous avez sélectionné une protéine.

6. Faites une copie séparée du fichier fasta téléchargé, et ouvrez-la dans un éditeur de texte simple (e.g. gedit, Notepad++).

7. Renommez les séquences, pour avoir des noms informatifs

   • La structure d'un fichier fasta. Le fichier fasta est un simple fichier texte qui contient une ou plusieurs séquences. Pour chaque séquence il y a une ligne d'identification, où le signe > est suivi d'une courte description de la séquence (identifiant, origine taxonomique, longueur etc.).
     Exemple d'en-tête fasta:

     >sp|P51490|OPSB_BOVIN Short-wave-sensitive opsin 1 OS=Bos taurus GN=OPN1SW PE=1 SV=1

     Cette ligne est suivie d'une ou plusieurs lignes contenant la séquence elle-même.

   • Pourquoi s'embêter à renommer les séquences ?
     Les logiciels d'alignement acceptent les fichiers fasta comme fichiers d'entrée, et utilisent les premiers caractères de la ligne d'identification comme identifiants de séquences. Dans le cas des séquences téléchargées à partir des banques des donnés, la première partie de ligne d'identification contient le numéro d'accession de la séquence. Cela est peu informatif pour les humains qui interprètent les résultats de l'alignement, donc il est préférable de renommer les séquences en plaçant en premier lieu les noms informatifs.

   • Comment renommer les séquences ?
     Le plus simple est d'insérer, tout au début de la ligne d'en-tête fasta, un idendifiant en un mot (pas d'espace), qui indiquera le nom de l'espèce et le spectre de sensibilité de l'opsine (bleu, vert, rouge, vert-rouge, ...). Par exemple, Chimp_blue désignera l'opsine sensible aux bleu (short-wave-sensitive) du chimpanzé (Pan troglodytus)

     Pour la traçabilité, vous pouvez éventuellement conserver l'en-tête original en commentaire sur la même ligne, mais veillez à placez l'identifiant informatif juste après le signe >.

     Par exemple, vous pourrez changer la ligne originale suivante:

     >sp|P60015|OPSB_PANTR Short-wave-sensitive opsin 1 OS=Pan troglodytes GN=OPN1SW PE=2 SV=1

     en insérant Chimp_blue juste après >:

     >Chimp_blue sp|P60015|OPSB_PANTR Short-wave-sensitive opsin 1 OS=Pan troglodytes GN=OPN1SW PE=2 SV=1

   • Ne laissez pas d'espace entre le signe > et votre identifiant

   • Séparerez votre identifiant du reste de la ligne par au moins un espace.

   • Les identifiants devrait être uniques (chaque identifiant dans le fichier devrait être différent) et courts (5-20 caractères).

8. Soumettez sur le l'AMeTICE le fichier de séquences fasta que vous avez édité, en suivant le lien 'Fichier fasta avec les séquences protéiques des opsines des mammifères'.

Par prudence, conservez une copie locale de vos résultats:

1. le fichier de séquecnes fasta original téléchargé de Uniprot:
2. la copie que vous avez éditée:

9. Préparez deux fichiers fasta séparés à partir de votre fichier avec les séquences renommées.

   1. Un qui contient uniquement les séquences d'opsines sensible à la lumière bleue (SWS)
   2. Un autre qui regroupera les opsines sensible à la lumière verte (MWS) et rouge (LWS) des primates

   Ces fichiers serviront à générer des alignements séparés pour les opsines bleues, et pour les autres opsines (vertes et rouges rassemblées).