Inférence phylogénétique

1. Connectez-vous au site de Tree of life project.

2. Cliquez sur l'image de la grenouille. Vous arrivez sur un page qui contient l'arbre des vertébrés terrestres. C'est arbre sera votre point de départ. Vous pouvez remonter dans l'arbre vers la racine (en cliquant sur la racine), ou descendre en cliquant sur une feuille.

3. A partir de ce point de départ, naviguez dans l'arbre pour atteindre l'ordre des mammifères (http://tolweb.org/Mammalia/15040).

4. Descendez ensuite dans l'arbre en cherchant le chemin qui mène à l'espèce humaine (Homo sapiens).

1. Récupérez le fichier texte contenant le nom latin des espèces sélectionnées ici, et sauvegardez-en une copie sur votre ordinateur.

2. Connectez-vous à la base de données taxonomique du NCBI.

3. Dans la liste Taxonomy tools, cliquez sur le lien Common tree.

4. A ce stade, deux alternatives s'offrent à vous.

   1. Entrer les noms d'espèces un à un dans la boîte Enter name or id, en cliquant Add pour chaque nom. Vous verrez ainsi l'arbre se dessiner progressivement.
   2. Entrer le fichier texte contenant la liste des espèces de votre sélection. Pour cela, cliquez Browse, localisez le fichier sur votre disque dur, puis cliquez Add from file. L'arbre complet devrait alors apparaître.

   Vous pouvez cacher ou afficher la lignée taxonomique des espèces à l'aide des boutons Expand All et Collapse All ou en cliquant sur les signes + et – devant les noms des taxa.

5. Sauvegardez la page Web de résultat, nous l'utiliserons pour un exercice ultérieur, afin d'effectuer la réconciliation entre l'arbre moléculaire des opsines et cet arbre des espèces.

Nous avons utilisé les séquences des opsines vertes et rouges des mammifères pour inférer les arbres des gènes de ces opsines à l’aide des algorithmes suivants :

• Méthode cladistique
  • Maximum de parcimonie
• Méthodes de distance
  • UPGMA
  • Neighbor Joining (NJ)
• Méthode statistique
  • Maximum de vraisemblance

Les arbres A, C, E étaient construits tels quels, sans aucune modification à posteriori (arbres originaux). Les autres arbres sont des modifications des arbres originaux. Ces modifications peuvent combiner une ou plusieurs des options suivantes :

• Placer la racine de l’arbre
• Pivoter/échanger les branches
• Changement de l’affichage cladogramme/phylogramme
• Élimination des nœuds peu soutenus par la valeur de bootstrap

Comparez les différents arbres et répondez aux questions

Arbres phylogénétiques

Cliquez sur un arbre pour l'ouvrir dans un nouvel onglet. Vous pourrez ensuite passer d'un onglet à l'autre pour comparer les arbres.

Arbre A. - Maximum de parcimonie (arbre original)

Arbre B. - Maximum de parcimonie (arbre modifié)

Arbre C. - UPGMA (arbre original)

Arbre D. - UPGMA (arbre modifié)

Arbre E. - Neighbor joining (arbre original)

Arbre F. - Neighbor joining (arbre modifié)

Arbre G. - Maximum de vraisemblance (arbre modifié, l'arbre original n'est pas affiché)

Arbre H. - Maximum de vraisemblance (arbre modifié, l'arbre original n'est pas affiché)

1. Récupérez le fichier (fasta) des séquences d'opsines de mammifères, que nous avions utilisé au TD4 (alignements multiples) ici.

2. Connectez-vous à Phylogeny.fr (http://phylogeny.lirmm.fr/).

3. Choisissez l'option A la carte dans l'onglet Phylogeny Analysis.

4. Créez un workflow (organigramme, c'est-à-dire une description graphique de l'enchaînement entre programmes bioinformatiques) en cochant/décochant les cases de chaque étape et en choisissant les logiciels pour chaque étape sélectionnée.

   Dans un premier temps, laissez toutes les options par défaut. Quand vous aurez acquis de l'expérience, vous pourrez modifier les paramètres pour analyser leur impact sur la topologie des arbres.

5. Sélectionnez l'option Step by step pour pouvoir examiner les résultats de chaque étape.

   Nous utilisons l'option "pas à pas" pour pouvoir explorer les paramètres et analyser les résultats intermédiaires à chaque étape. Quand vous aurez acquis une maîtrise suffisante de l'inférence phylogénétique, vous pourrez utiliser l'option all at once, qui fera tourner toutes les analyses et vous avertira par courriel de la complétion de la tâche.

6. Créez le workflow (bouton Create Workflow)

7. Cliquez sur Browse pour charger votre fichier fasta sur le site Phylogeny.fr, ou (si vote fichier est de taille raisonnable) copiez les séquences dans la fenêtre prévue.

8. Nous vous suggérons d'indiquer votre courriel, afin de recevoir un courriel de notification des résultats.

9. Lancez l'analyse en cliquant sur le bouton submit.

• Vous pouvez ignorer les éventuels messages d'avertissement (warnings) "sequence #1 name is too long (greater or equal to 80 characters)"

• Le site Web affiche des onglets correspondant à chaque étape du workflow. Chaque fois qu'une étape est terminée, le lien "Res." devient actif dans l'onglet.

10. Cliquez sur le lien Res. de l'onglet Alignement. Vérifiez l'alignement pour éliminer éventuellement quelques séquences qui s'alignent mal.

    Quand le fichier de séquence contient quelques séquences très éloignées, la tâche d'alignement multiple est particulièrement difficile. Ces séquences nuisent à la fiabilité de l'alignement, et, indirectement, à l'inférence d'un arbre moléculaire. Il est préférable de les éliminer avant la construction d'arbre phylogénétique. Dans le cas des opsines, la conservation est suffisamment bonne, et couvre l'ensemble des séquences. Nous pouvons donc travailler avec l'ensemble des séquences que nous avons collectées.

11. Au bas de la page de résultats de l'alignement, cliquez Next Step pour passer à l'étape suivante.

1. Nous passons maintenant à l'étape dite de curation. Cette étape est optionnelle. Elle permet de "nettoyer" l'alignement multiple, pour n'en retenir que les sites (colonnes de l'alignement) pertinents pour l'inférence phylogénétique qui suivra.

   Dans un alignement multiple la position des gaps est souvent ambiguë, si les séquences ne sont pas fortement conservées. Pour cette raison, il est préférable de se baser sur les blocks (colonnes contigües dans l’alignent) sans gap pour inférer des arbres phylogénétiques.
   Le logiciel Gblock ne fait pas qu'enlever les colonnes de l’alignement avec gaps, mais il élimine aussi les blocks sans gap trop courts, car ces positions se trouvent dans une région de l’alignent relativement peu fiable.

2. Le site Phylogeny.fr vous propose de changer les paramètres par défaut pour appliquer des conditions plus ou moins exigeantes ("stringent" en anglais) à la sélection des sites (colonnes de l'alignement) qui seront pris en compte lors de la construction de l'arbre.

3. Laissez tous les paramètres par défaut, et cliquez submit.

1. Au bas de l'onglet Curation Res, cliquez sur le bouton Next step. Ceci vous amène à l'onglet Phylogeny Set.

2. Si vous utilisez la méthode de maximum de vraisemblance, choissiez SH-like dans le menu Approximate Likelihood-Ratio Test (aLRT). Si vous utilisez un autre méthode de construction d'arbre phylogénétique, assurez-vous que l'option Bootstrap soit à 0.

   • L'option de bootstrap est fort utile pour mesurer la robustesse de votre arbre, mais elle est gourmande en temps. Pour ce premier essai, nous désactivons l'option de bootstrap, mais pour votre arbre final vous pouvez utiliser cette option.
   • Ils existent les méthodes alternatives pour évaluer les robustesse des branches, qui sont plus rapides que le bootstap, mais moins précises.

3. Laissez les autres paramètres inchangés, et lancez la construction de l'arbre phylogénétique en cliquant Submit.

   Cette tâche peut prendre quelques minutes, le moment est sans doute venu de prendre une pause.

Après quelques minutes, la page de résultats s'affiche. L'arbre phylogénétique s'affiche dans un format très simple, qui ne permet pas de le manipuler directement (par exemple pour pivoter les branches, renommer les séquences, enraciner l'arbre, ...).

• En dessous de cette figure, la page de résultat vous présente une série d'options que vous pouvez modifier afin d'adapter le dessin en fonction des résultats, et de vos goûts personnels.
• Vous pouvez également exporter le résultat sous différents formats, qui vous permettront de les ouvrir avec des logiciels de visualisation et manipulation d'arbres phylogénétiques.

4. Prenez le temps de découvrir les différentes manipulations possibles avec l'arbre.

5. Coloriez quelques branches de couleurs différentes, pour pouvoir bien comprendre l'effet des options qui changent l'affichage des branches.

1. Utilisez le format cladogramme en activant l'option Ignore branch length.

2. Colorez les branches de votre arbre de manière à associer les couleurs rouge, verte et bleue en accord avec les types d'opsines.

   • Pour colorer une branche, sélectionnez d'abord une couleur (option Dynamic Tree Edition > Color > using color), puis cliquez sur l'icône carrée devant Color, remontez sur le graphique de l'arbre, et cliquez sur la branche que vous voulez colorer.

   • Utilisez la couleur brune pour marquer les opsines pour lesquelles la distinction entre vert et rouge n'est pas établie. Pour la majorité des mammifères il y a un seul gène qui code pour l'opsine verte/rouge. Même s'il sont annotés comme opsines rouge ou verte coloriez les en brun et utilisez les couleur verte est rouge que pour les primates, qui possèdent 2 gènes, un pour le rouge, l'autre pour le vert

   • Pour mieux voir le détail des branchements les plus récents, activez l'option Ignore branch lengths. Ceci affichera le résultat sous forme de cladogramme, ce qui facilitera grandement le coloriage des branches de l'arbre. Vous pourrez ensuite revenir au mode phylogramme pour sauvegarder le résultat final.

   • De manière générale, nous vous recommandons de sauvegarder systématiquement les résultats de vos analyses phylogéniques sous les deux formes (cladogramme et phylogramme), car ces modes de visualisation sont complémentaires.

3. Dans une fenêtre séparée, ouvrez l'arbre des espèces que vous aviez généré sur l'outil Common tree du site taxonomique du NCBI. Comparez cet arbre des espèces avec le branches bleue et puis avec la branche rouge/verte de votre arbre inféré. Notez particulièrement, si la position des groupes des monotrèmes, primates et eutheria et correcte dans l'arbre inféré.

4. Enregistrez votre arbre en format pdf.

5. Soumettez votre arbre en format pdf par le lien prévu sur le site Ametice (Arbre phylogénétique)